生物样品多种多样，但都具备三维结构。要研究其功能结构自然就要获得其三维信息。获得三维信息有许多方法，现阶段人们常用的多是利用断层扫描的方式获得样品内部逐层的断层信息再经过三维重构处理进而获得样品的三维结构。
显微镜的发明开启了生命科学微观研究的大门，但人们为了获得微观样品的三维结构却经历了漫长的岁月。这其中共聚焦显微镜的发明具有里程碑的意义，同样在近些年流行起来的光片显微镜也另辟蹊径实现了微观样品的断层扫描成像。无论是通过共聚焦还是光片显微镜都是利用光学的方式而实现的断层成像，因而人们一般都称其为“光学切片”成像。
共聚焦显微镜各位读者应该都比较熟悉。在我们日常的显微成像工作中当提到“共聚焦显微镜”时往往是特指共聚焦显微镜中的一种——点扫描共聚焦显微镜！
其实严格来说“共聚焦显微镜”是一个大的分类，指通过共聚焦的方式实现荧光标记样品光学切片的一类显微镜。
下文就让我们来探究下接下来的几个问题：
1）共聚焦显微镜的原理
2）共聚焦显微镜都有哪些？——点扫描及转盘共聚焦
3）点扫描共聚焦与转盘共聚焦的比较
4）光片显微镜的原理
5）光片显微镜与共聚焦显微镜的比较
1） 共聚焦显微镜的原理
让我们通过图示来简单了解一下共聚焦的原理。
如图绿色的平行激光进入光路通过物镜被汇聚到物镜的焦点上，样品被绿光激发发出红光。这里我们要注意在焦点上下的空间也会被绿光激发，同样也会发出红色的发射光。
我们先只考虑从焦点发出的光（既图示中的粉红色）其再返回物镜并经筒镜再次汇聚到共焦点的位置，也就是针孔的位置（针孔就是一透光的小孔），那么来自焦点的光线自然可以顺利的通过针孔。
焦点之外的光线（图中蓝线所示）会汇聚在共焦点之外的位置，所以就不能顺利的通过针孔。
如此一个简单的针孔结构就可以将来自焦点之外的光线过滤而只保留焦点上发出的光线了。
因此“共聚焦”正可以表示这一通过共焦点的方式而排除焦外光线干扰的成像方式。
2）共聚焦显微镜都有哪些？
其实上面的故事还没有结束！通过共聚焦的方式利用针孔过滤掉焦点外的干扰后，但实际上我们只获得了一个点的信号。
我们如何获得一张完整的图像呢？答案是——扫描。逐点扫描即可得到一张完整的来自一个焦平面的图像，这样我们才最终实现了对样品的所谓光学切片。
那么如果只有一个点在扫是不是显得效率有点低下？实际上早已有人尝试了不同的针孔模式，如下图。可以用一条线来扫，这时可以称为线扫描共聚焦。可以用一排小孔来扫，更可以用一片小孔来扫描，这时都可以称为多点扫描共聚焦。
但经过多年的发展，线扫描和单排小孔扫描的方式已经基本被市场淘汰。而只剩下上图最右的多点扫描方式。
这类扫描方式是通过下图所示的转盘而实现的。如图转盘上成一定规律螺旋分布着众多小孔。当转盘旋转时众多针孔划过的空间会逐渐叠加而最终完整覆盖扫描的区域。
由于转盘共聚焦众多针孔同步扫描，使其扫描通量可以大大的超过点扫描共聚焦。进而获得远高的扫描速度及通光量。
由于转盘共聚焦需要同时检测众多点的信号，所以需要使用相机进行成像。现阶段最新的相机具备出色的速度（可超过100fps）和极为出色的灵敏度（光电转换效率可达95%）。转盘共聚焦本身的高通光量再叠加相机的高灵敏度，使其非常适合微弱荧光样品的成像。而且转盘共聚焦可以利用很弱的激发光而获得不错的图像，再结合其极高的速度（单次照射时间短），这两者叠加又使其具备非常低的光毒性。
3）点扫描共聚焦与转盘共聚焦显微镜的比较
由于现今在共焦成像领域几乎都是使用点扫描共聚焦及转盘共聚焦。其中又以点扫描共聚焦居多（在国内可能占有80%以上的比例），所以当人们在谈到“共聚焦”的时候一般都是只点扫描共聚焦。
前文我们谈到其实转盘共聚焦具备了速度快、灵敏度高及光毒性低的三大优势，但为什么转盘没有代替点扫描共聚焦呢？
事物都具有两面性，我们先看下图。第一转盘具有众多小孔，在技术上我们是无法调节其大小的（b图D值）。只能让其匹配某一颗物镜，比如图中的D为50um，此直径刚好匹配100X物镜，当使用低倍物镜时都大于最佳的针孔大小而使其切层效果变差。
第二针孔间距（b图S值）越小可以获得更快的速度和更高的通光量但同时会更容易通过其他位置焦面外荧光的干扰（e，f图中边缘的小孔获得了中间位置焦面外的荧光干扰）这就同时削弱了成像的分辨率和切层效果。但小孔间距过大的话，相反的其速度和图像亮度就会大大的削弱。
第三转盘共聚焦使用相机作为成像设备，其也带来一个不足就是相机的像素尺寸是固定的，使其无法匹配不同的应用需求。当选择大像素时图像亮度高，但使用低倍物镜会分辨率偏低。当使用小像素时分辨率好一些但图像亮度又会偏低。
而与此相反点扫描共聚焦可以很好的解决上面的问题。第一针孔可调可以完美匹配任何物镜和任何激光。第二只有一个针孔没有任何的相邻针孔干扰。
第三没有所谓的像素尺寸，而且可以以任意的调整扫描区域及扫描的分辨率。完美匹配样品的分辨率与形状及方向（见下图）。
此外由于点扫描共聚焦的激光只集中在一个点上，而具备极高的光密度，使其可以十分充分的激发荧光。特别是对于固定样品（由于不需要再次使用而不必太在乎光漂白及光毒性）点扫共聚焦可以获得明亮清晰的图像。
点扫描共聚焦可以非常充分的激发而获得十分出色的画质。而且不同厂家也推出了结合共振扫描的高速点扫共聚焦，如此可以在一定程度上拉近与转盘的速度差距。可以参考尼康AX共聚焦共振扫描介绍。
简单总结，点扫共聚焦具有普遍的适用性，适用于各种物镜，各种常规样品的从宏观到微观细胞亚结构的观察。转盘共聚焦适用于对速度有迫切要求的实验（如大批量切片扫描，肌肉钙离子等运动样品）及对光毒性较敏感样品（如胚胎观察）的三维拍摄。
4）光片显微镜的原理。
光片荧光显微镜（Light Sheet Fluorescence Microscopy）这一形象的名称可以让我们很容易理解其工作方式。如下图，既是用片层状的照明从侧面照射样品，这样只有这一断层上的样品才被照亮，另一成像物镜在上侧直接拍摄就可以得到这一断层的图像。然后通过样品的上下移动就可以获得样品中完整的三维信息。
5）光片显微镜与共聚焦显微镜之比较。
光片显微镜具有相比共聚焦更佳的光线利用率。因为共聚焦需要利用针孔过滤，所以实际样品所发出的荧光并不能全部利用。而光片显微镜的全部荧光都会被用来收集成像。
因此光片显微镜会有比转盘共聚焦更快的速度，更高的灵敏度及更低的光毒性！这些特性使其非常适合脆弱样品的极高速三维成像。
但光片显微镜也存在诸多的限制。一是由于采用侧面照明而几乎所有的常规切片和培养皿的样品都无法观察，体积较大的样品也由于照明无法穿过而无法观察。二是由于都要观察一定体积的样品而需要很长工作距离的物镜（一般固定使用一颗物镜），这大大限制了成像分辨率。所以现阶段比较适合的样品是各类胚胎初期的观察，较小的组织块及透明化的大一些的样品，并且一般是用于细胞群体的观察，对细胞亚结构的观察就比较吃力了。
如果我们把点扫、转盘、及光片显微镜在速度、灵敏度、光毒性、深度、画质及适用性方面来区分的话可以概略的得到下图：
我们通过上图再专门看一下其适用性。显然点扫共聚焦可以适应更广泛的样品，所以日常的科研也使用的最多。其次是转盘共聚焦，也可以利用各种物镜，但主要是用于对速度有很高要求的应用。对于光片显微镜就只能局限于特异的样品，但却具备出色的速度表现。
本文由于篇幅所限，我们只简单介绍了点扫、转盘及光片这三种三维显微成像工具。其他还有多光子共聚焦，结构照明，还有反卷积软件算法等多种技术可以实现荧光样品的三维成像。也有不使用荧光技术的全息显微镜，也可以得到样品的三维信息。
此外各类超分辨显微技术也可以得到样品的三维数据。
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转载于尼康仪器生物显微镜
